Einleitung und Zielsetzung
Die DNA-Extraktion bei Vögeln kann aus verschiedenen Körperteilen wie Federn, Muskeln oder anderen Körpergeweben wie Blut durchgeführt werden. Die aus diesen verschiedenen Teilen gewonnene DNA-Probe ist jedoch von unterschiedlicher Qualität, und als beste DNA-Probe gilt die aus Blut gewonnene. In dieser Hinsicht wird nur eine kleine Blutprobe für Analysen wie VNTR benötigt. Trotz dieses großen Vorteils von DNA-Proben aus Blut gibt es einen großen Nachteil im Zusammenhang mit solchen Proben.
Blut ist anfälliger für Verunreinigungen, insbesondere wenn es unsachgemäß gelagert wird. Außerdem trocknet Blut an der Luft leicht aus, was die Menge der zu extrahierenden DNA einschränkt. Muskelgewebe ist eine weitere gute Quelle für DNA-Proben. Der Extraktionsprozess ist jedoch recht anspruchsvoll und könnte zerstörerisch sein. DNA-Proben können auch aus Federn gewonnen werden, aber die Qualität solcher Proben ist geringer als die von Blut oder Muskelgewebe.
Bei der DNA-Extraktion aus Federn kann es vorkommen, dass die gesamte Feder keine Proben-DNA enthält. Daher ist es wichtig, die Extraktion von DNA aus der Federspitze oder einem Blutfleck an der Federspitze zu erwägen.
Organismen können entweder heterogametisch oder homogametisch sein. Organismen, die ähnliche Geschlechtschromosomen haben, werden als homogametisch bezeichnet, während Organismen mit unterschiedlichen Geschlechtschromosomen als heterogametisch bezeichnet werden. Weibliche Menschen haben XX Geschlechtschromosomen und gelten daher als homogametisch. Männchen hingegen haben XY-Geschlechtschromosomen und gelten daher als heterogametisch. Bei Organismen aus der Klasse der Vögel ist das anders: Männchen sind homogametisch, da sie ZZ-Geschlechtschromosomen haben, während Weibchen heterogametisch sind und ZW-Geschlechtschromosomen haben.
Im Gegensatz zum Menschen sind Vögel monomorph. Das bedeutet, dass sie nicht anhand ihrer phänotypischen Merkmale unterschieden werden können. Dies erfordert die Verwendung von Primern zur Geschlechtsbestimmung, um Größenunterschiede zwischen dem Z- und dem W-Chromosom festzustellen, und die anschließende Visualisierung der isolierten DNA durch Gelelektrophorese. Die Ergebnisse der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus einer solchen Analyse zeigen zwei deutliche Banden zur Unterscheidung der Weibchen, während die Ergebnisse der Männchen nur eine deutliche Bande zeigen.
Das Experiment zielte hauptsächlich darauf ab, das Geschlecht von Gallus gallus durch ein praktisches Verfahren zu bestimmen. Zunächst sollte eine DNA-Extraktion aus der Vogelprobe durchgeführt werden. Die DNA wurde aus Blut, Muskelgewebe und Federn des Vogels gewonnen. Anschließend wurde die DNA-Konzentration bestimmt und CHD1 mittels PCR amplifiziert. Der letzte Schritt bestand darin, den DNA-Extrakt durch Gelelektrophorese sichtbar zu machen und Rückschlüsse auf das Geschlecht des Vogels zu ziehen.
Methoden und Materialien
Dem Vogel wurde ein kleiner Teil von etwa 2-3 mm einer Federspitze entnommen. Das Stück wurde in mehrere Teile geteilt, da wir keinen Blutfleck aus der Feder gewinnen konnten. Diese Teile wurden dann sterilisiert, indem sie in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 180 µl ATL-Puffer getaucht wurden. Anschließend wurden sie etwa 15 Sekunden lang mit dem Vortex gemischt. Anschließend wurden 20 µl Proteinase K zugegeben und weitere 15 Sekunden lang mit dem Vortex gemischt, bevor sie 30 Minuten lang bei 560 °C inkubiert wurden. Während dieser Inkubation wurde in Abständen von 10 Minuten mit dem Vortex gemischt. Die Probe wurde dann lysiert und im Vortex gemischt, bevor 200 µl AL-Puffer zugegeben und der Vortex weitere 15 Sekunden laufen gelassen wurde. Dann wurden 200 µl absolutes Ethanol (96 %-100 %) zugegeben und der Vortexer wurde weitere 15 Sekunden lang laufen gelassen, um eine homogene Lösung zu erhalten.
Das DNeasy-Spin-Säulenröhrchen wurde aus einer sterilen Blase entnommen und etikettiert. Die Mikrozentrifugenmischung wurde dann in die DNeasy-Einheit überführt und 1 Minute lang bei 8000 U/min zentrifugiert. Die Säule wurde dann in ein 2ml-Sammelröhrchen gegeben, dem 500µl AW2-Puffer hinzugefügt wurden. Dieses wurde dann 3 Minuten lang bei 17000 U/min zentrifugiert. Dies trug zur Trocknung der DNeasy-Membran bei.
Das DNeasy-Röhrchen wurde geleert und die Spinsäule und das Sammelröhrchen 1 Minute lang bei 17000 U/min zentrifugiert, um das möglicherweise verbliebene Ethanol zu trocknen. Das DNeasy-Röhrchen wurde in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt, das 50 µl AE-Puffer enthielt, und 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde eine Minute lang bei etwa 8000 U/min zentrifugiert. Das DNA-Isolat wurde anschließend bei -200 °C gekühlt, während die Sammelsäule verworfen wurde. Die DNA-Isolierung aus Muskel- und Blutgewebe unterschied sich deutlich.
Die Visualisierung der isolierten DNA erfolgte durch Agarosegel-Elektrophorese. Das Gel wurde aus 1% (w/v) Agarose in 1x TAE-Puffer hergestellt. Diese wurde zum Auflösen gekocht und dann auf 500°C abgekühlt. Als Farbstoff wurden etwa 15 µl Cybercafé anstelle von Ethidiumbromid verwendet. Das Gel hatte 30 Minuten Zeit, sich zu setzen, bevor der Gelkamm entfernt und 10 µl der isolierten DNA mit 2 µl des Ladefarbstoffs gemischt wurden. Anschließend wurde TAE-Puffer in das Gel gegossen, um es vollständig zu bedecken. λ HindIII-Marker (5 µl) wurden angebracht.
Auf die erste und die letzte Vertiefung wurde mit einer Mikropipette eine 2-log-Leiter aufgetragen, bevor das Gel 60 Minuten lang bei 120 V betrieben wurde. Die DNA ist negativ geladen und läuft daher von der Kathode zur Anode. Das Gel wurde dann in einen Plastikbehälter gegeben, wo es mit dem Gel-Doc-System visualisiert und die Konzentration bestimmt wurde.
Da in den nachfolgenden Verfahren mehr DNA benötigt wurde, war eine Vervielfältigung der DNA-Probe unumgänglich. Dies wurde mit Hilfe der PCR erreicht. Es wurde ein Mastermix hergestellt, der die unten angegebenen Konzentrationen enthielt:
Anschließend wurden 40 µl des Mastermixes in 0,2-ml-PCR-Gefäße pipettiert und 10 µl des DNA-Isolats hinzugefügt. Zur Sicherheit wurden auch eine männliche, eine weibliche und eine negative Kontrolle durchgeführt. Insgesamt wurden 7 Röhrchen vorbereitet, darunter 4 Reaktionsgefäße und 3 Kontrollen.
Die Röhrchen wurden in einen Thermocycler überführt, wo die Amplifikation von CHD1Z und CDH1W mit den Primern 2250F-2718R stattfand. Die PCR-Produkte wurden dann mittels Gelelektrophorese in 1% Agarose in 1x TB-Puffer untersucht. Es wurde ein ähnliches Verfahren zur Gelvorbereitung wie zuvor beschrieben angewandt, jedoch wurde SB-Puffer anstelle von TAE verwendet, und der verwendete genetische Marker war 5µl von 100bp Länge anstelle von λ HindIII. Für den Betrieb des Gels war eine höhere Spannung erforderlich, weshalb statt 120 V eine Spannung von 300 V für 20 Minuten verwendet wurde.