Einführung
Die Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR) ist ein optisches Verfahren, das bei der Klassifizierung sowohl von dünnen Schichten als auch von Grenzflächen häufig eingesetzt wird. Die dieser Technik zugrunde liegenden Prinzipien sind in der Literatur weithin bekannt. Analysen, die von der Empfindlichkeit dieser Technik profitieren, sind solche, die als bioaktiv gelten.
An diesem Punkt haben wir ein Reaktionspaar, bei dem sich ein Partner chemisch an die biofunktionale Schicht anlagert und der andere Partner den Oberflächenplasmonenmodus trägt, während er den Kontakt mit dem Analyten aufrechterhält. Wenn die Analytmoleküle die Lösung verlassen, bewirken sie eine entsprechende Änderung des Brechungsindexes. Dies kann in Echtzeit und in einem markierungsfreien Verfahren untersucht werden. Kurz gesagt, es wird ein quantifizierbares Sensorsignal erzeugt, sobald die Analytmoleküle nachgewiesen sind.
Ein Nachteil dieser Technik ist jedoch, dass das Sensorsignal unbemerkt bleiben kann, wenn die Anreicherung (Dichte) des Analyten extrem niedrig ist oder die Moleküle sehr klein sind, um Signale zu erzeugen. Zu den Techniken, die zur Begrenzung dieses Problems eingesetzt werden, gehört die Anwendung einer “quasi-dreidimensionalen Oberflächenschicht aus einem Hydrogel oder einer Polymerbürste, die durch Oberflächenplasmonenwellen untersucht wird, was zu einer effektiven Erhöhung der Dichte der Bindungsstellen führt” (Ford & Weber, 2013). Dennoch bleiben viele relevante Analytkonzentrationen unerkannt.
In jüngster Zeit hat die Einführung der feldverstärkten Oberflächenplasmonen-Fluoreszenzspektroskopie (SPFS) dazu beigetragen, diese Nachweisgrenze vollständig zu beseitigen.
Das dieser Technik zugrunde liegende Prinzip besteht darin, dass ein übergeordnetes elektromagnetisches Feld, das von einem Oberflächenplasmon ausgeht, zur Anregung von oberflächengebundenen Fluorophoren verwendet wird (Wolfgang & Neumann, 2013). Infolgedessen wird die emittierte Fluoreszenz schließlich analysiert, um das Verhalten des Analyten widerzuspiegeln. Die folgende Abbildung ist eine schematische Darstellung des SPFS (Stewart & Thompsons, 2008).
Seit ihren Anfängen hat die SPFS-Technik eine Reihe von Meilensteinen erreicht. Sie wurde erfolgreich eingesetzt, um fluorophor-markierte Moleküle aufzuspüren, Studien auf der Grundlage von Primerverlängerungsreaktionen zu analysieren, die Grenzflächenhybridisierung zu untersuchen, Oberflächen abzubilden, die Wechselwirkung zwischen Antikörpern und Antigenen zu untersuchen und Studien über Kolloide durchzuführen. Seine Bedeutung ist jedoch nicht auf die oben genannten Anwendungen beschränkt. Es gibt noch viele weitere Bereiche, in denen sich diese Technik bewährt hat. Im Rahmen dieser Übersicht beschränken wir uns auf die oben genannten Anwendungen.
Rückverfolgung von mit Fluorophoren markierten Molekülen (Aflatoxin M1 in Milch)
Vor der Entdeckung von SPFS waren die bestehenden Techniken nicht in der Lage, kleinste Mengen von Analyten in Echtzeit zu untersuchen. Dies hatte zur Folge, dass diese Techniken bei Analysen, die strenge Maßstäbe erfordern, wie z. B. bei der Proteomik, unbrauchbar waren. Seit ihrer Einführung im Jahr 1999 hat die SPFS diese Analysen ermöglicht und liefert genaue und zuverlässige Ergebnisse.
Neben der konventionellen SPR-Spektroskopie, die die Dickenänderungen an der Grenzfläche untersucht, bietet SPFS “einen Fluoreszenzsignalkanal, der die biomolekulare Bindungskinetik auf hochempfindliche Weise direkt überwachen kann” (Duque et al., 2012). Dennoch wird die einfallende Fluoreszenz, die von den Fluorophoren ausgeht, durch Metalle in der Größenordnung von weniger als 10 nm Farbstoff-Metall-Abstand erheblich abgeschwächt.
Dies schränkt die Vorteile der SPR-Feldeffekte ein. Außerdem wird eine drohende Signalabweichung, ein unerwünschter Effekt, erwartet. Dieses Signal entsteht durch einen kombinierten Effekt des schwindenden “Oberflächenplasmonenfeldes und des metallinduzierten Quenching” (Huang & Yu, 2013).
In letzter Zeit wurden Anstrengungen unternommen, um das Problem des Farbstoff-Metall-Abstands zu verringern. Diese Strategien, zu denen unter anderem die Schicht-für-Schicht-Strategie gehört, zielen darauf ab, den Farbstoff-Metall-Abstand zu optimieren. Für diese Analyse wird eine räumlich ausgedehnte Matrix als verbindliche Vorlage verwendet, die für die Überwindung der oben genannten Nachteile entscheidend ist.
Für den Nachweis von Aflatoxin M1 in Milch wird ein neuartiger Biosensor eingesetzt, der extrem empfindlich ist. Der Biosensor basiert im Wesentlichen auf einem bereits fortgeschrittenen SPFS, der “die Anregung von Langstrecken-Oberflächenplasmonen (LRSPs)” nutzt (Fang & Bjorn, 2013). Bei der SPFS werden die mit Fluorophoren markierten Elemente an die Sensoroberfläche gebunden. Gleichzeitig wird diese Reaktion mit Oberflächenplasmonen (SPs) untersucht, die zu einer Fluoreszenz führen, die Signale an den Detektor sendet.
Wie bereits erwähnt, nutzt das angewandte Prinzip die erhöhte Feldstärke, die aus der Anregung von Oberflächenplasmonen resultiert, um das daraus resultierende Fluoreszenzsignal zu verstärken. Um einen Nachweiseffekt zu erzielen, sollten sowohl die LRSP-verstärkte Fluoreszenzspektroskopie als auch ein Inhibitor-Immunoassay miteinander kombiniert werden.
Zu diesem Zeitpunkt wird das Derivat Aflatoxin M1 auf der Oberfläche des Sensors lokalisiert. Die Antikörper, die typischerweise gegen Aflatoxin M1 gerichtet sind, dienen dabei als Erkennungselemente. Auf diese Weise kann das Aflatoxin M1 dank des Biosensors leicht nachgewiesen werden.
Studien auf der Grundlage von Primer-Verlängerungsreaktionen
Das Enzym DNA-Polymerase ist ein wichtiger Katalysator, der von Biotechnologen bei der In-vitro-Herstellung von doppelsträngiger DNA eingesetzt wird. Diese Enzyme sind sowohl bei der DNA-Sequenzierung als auch bei PCR-basierten Verfahren, die für die Feststellung von Mutationen unerlässlich sind, von großem Nutzen.
Methoden, die einzigartige Enzymfunktionen zur Feststellung der Identität einer Basensequenz verwenden, wie z. B. DNA-Ligation, Verdauung, Restriktion und Primerverlängerung, sind im Allgemeinen empfindlicher für Basenaberrationen als solche, die nur auf DNA-Hybridisierungsreaktionen basieren” (Giannini et al., 2012). Die aktuellen Verfahren zielen darauf ab, sowohl die operative Kompetenz als auch die Empfindlichkeitsgrenzen zu verbessern. Einer der am häufigsten verwendeten Ansätze analysiert DNA-Mikroarrays durch die Untersuchung der Fluoreszenzintensitäten.
Moderne Verfahren erforschen die Oberflächenanhaftung der reagierenden Verbindungen, um ihre Prinzipien auszuführen, bei denen es sich in der Regel um Echtzeitmethoden handelt. Zu diesen Verfahren gehören die Quarzkristallmikrowaage (QCM) und die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR). Diese beiden Verfahren wurden erfolgreich zur Untersuchung der RNA- und DNA-Polymerase-Profile eingesetzt.
Grundsätzlich ist dieses Verfahren vielseitiger als die bisherige DNA-Microarray-Methode, da es Informationen über die Kinetik der Enzyme liefert. Mit diesen Informationen ist man besser in der Lage, die Dynamik der Interaktion zu verstehen. Trotz ihrer Kompetenz bei der Analyse der DNA-Synthese sind sie nicht in der Lage, die Ereignisse des Nukleotideinbaus zu überwachen. Das liegt daran, dass sie die entsprechenden Miniatur-Massenänderungen nicht erfassen können.
Die SPFS-Methode ist für den Nachweis dieser vernachlässigbaren Massenveränderungen sehr nützlich. In diesem Bericht wird eine Studie vorgestellt, die zeigt, wie SPFS zur Untersuchung der katalytischen Wirkung bei der Integration von “fluoreszenzmarkierten Nukleotiden in oberflächengebundene Oligonukleotide” verwendet wurde (Dostálek & Knoll, 2013).
Bei SPFS verstärkt ein kurzes elektromagnetisches Feld, das von der Oberflächenplasmonen-Mode ausgeht und parallel zur Gold-Wasser-Grenzfläche übertragen wird, die Anregung der oberflächengebundenen Flourophore. Die Resonanz der Anregung ist abhängig vom Brechungsindex der Grenzschicht. Dies kann durch Änderung des Einfallswinkels des Anregungslichts verstärkt werden.
Bei Resonanz wird das resultierende Grenzflächenfeld zwei Oktaven höher als das einfallende Licht verstärkt (wenn die Grenzfläche λ auf 633 nm eingestellt ist) (Tawa & Knoll, 2013). Die optimale Stärke, die exponentiell zur Oberfläche abklingt, wird an der Grenzfläche realisiert. Die Verstärkung des evaneszenten Feldes verleiht der SPFS ihre hohe Empfindlichkeit, wodurch sie sich von der TIRF-Spektroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence) unterscheidet.
SPFS-Spektroskopie, angewandt bei der Analyse der Grenzflächenhybridisierung
Die Fortschritte bei der Entwicklung von DNA-Biosensoren, die ihnen eine unvergleichliche Empfindlichkeit und Selektivität verleihen, sind den Erfolgen des Humangenomprojekts (HGP) zu verdanken. Einige Biosensoren, darunter akustische Wellen, faseroptische Sensoren und oberflächenbasierte Plasmonen, haben erfolgreich Oligonukleotide analysiert und dabei eine unmittelbare Überprüfung der Hybridisierungskinetik erreicht.
Dennoch haben sich diese Techniken beim Nachweis von PCR-amplifizierter DNA nicht bewährt. Idealerweise sind Oligonukleotide und PCR-Produkte unähnliche Analyten, die sich vor allem in zwei Aspekten unterscheiden (Knoll, 2012). Erstens liegt der Unterschied in der jeweiligen Länge der Basen, aus denen sie bestehen. Oligonukleotide, die in der Biosensing-Analyse verwendet werden, sind in der Regel weniger als 30 Basen lang. Dies wird durch die Länge der PCR-Produkte, die mehrere Kilobasen (kb) umfassen, in den Schatten gestellt.
Diese riesige Menge an Basen in Verbindung mit der Komplexität der Sequenzierung stellt ein großes Hindernis bei der Analyse von PCR-Produkten dar. Zum Beispiel können einige der nicht-selektiven Teile der Produkte den Hybridisierungsprozess gefährden, indem sie physikalisch an den oberflächengebundenen Sonden haften, wodurch hohe Hintergrundsignale entstehen. Außerdem erhöht das Vorhandensein dieser nicht-selektiven Teile das Ausmaß der sterischen Hinderung, was die Wirksamkeit der Bindung von PCR-Produkten einschränkt.
Zweitens sind die PCR-Produkte in der Regel doppelsträngig. Dies ist ein großer Nachteil, der den Erkennungseinheiten den Zugang zu den oberflächengebundenen Sonden verwehrt. Infolgedessen ist die Empfindlichkeit der Analyse stark eingeschränkt. Bei diesen Techniken werden nur die Endpunktergebnisse angegeben. Daher bieten diese Techniken keine tiefgreifende Analyse des Hybridisierungsmechanismus. Dies kann nur die SPFS bieten (Robelek et al., 2013).
In dieser Übersicht wird analysiert, wie SPFS zur Überprüfung der Hybridisierung von PCR-Produkten mit PNA-Sonden (Peptidnukleinsäuren) eingesetzt werden kann. Dabei wurde zunächst die Bedeutung des Antisense-Strangs bei der Hybridisierung deutlich gemacht. In diesem Zusammenhang wurden drei PCR-Produkte entwickelt und anschließend durch Markierung unterschieden. Dazu gehörten der sense-, der antisense- und der sense-antisense-Doppelstrang.
Diese wurden dann vor einem Hybridisierungsprozess mit oberflächengebundener PNA (bei 10 mM NaOH) einem Hitzedenaturierungsprozess unterzogen. Diese wurden dann mittels SPFS in Echtzeit überwacht. Die erzielten Ergebnisse zeigten, dass die Sense-Antisense-Stränge ein etwas höheres Hybridisierungssignal als der Sense-Strang aufwiesen. Das geringere Signal des Sense-Strangs wurde durch die Antisense-Stränge verursacht, die eine schwache Fluoreszenz aufwiesen.
Nach dem Denaturierungsprozess assoziieren die ursprünglich getrennten Doppelstränge wieder miteinander, abhängig von der NaOH-Konzentration (Kellis & Poulose, 2012). Im Prinzip hemmt eine höhere Salzkonzentration die Abstoßung zwischen den denaturierten Strängen.
Wie die SPFS-Technik zeigte, waren während des gesamten Hybridisierungsprozesses nur wenige Antisense-Stränge an die Oberfläche gebunden. Dies verdeutlicht die Bedeutung der SPFS-Technik für die Überwachung des Hybridisierungsprozesses. Bei diesem Prozess geht es um dezimale Komponenten, die die Empfindlichkeit erfordern, die durch die oben genannte Technik gewährleistet wird.
SPFS-SPRM, wie es bei der Oberflächenabbildung verwendet wird
Einfach ausgedrückt, sind Oberflächenplasmonen durch Schwingungen der Ladungsdichte gekennzeichnet, die an der Grenzfläche zu Medien auftreten. Die Resonanz, die an den Oberflächenplasmonen auftritt, wird erreicht, wenn zwei Wellenvektoren (p-polarisiertes Licht und der der Oberflächenplasmonen) übereinstimmen. Dies führt zu einer Abnahme des Photonenflusses, der von der Mediengrenze ausgeht.
Die von den Oberflächenplasmonen erzeugten Felder “interagieren mit den unmittelbaren Medien, die die Grenzfläche umgeben, um dann exponentiell zu den Medien abzufallen, wobei die Abklingrate von den verwendeten Medien abhängt” (Attridge et al., 2013). Wie von Attridge et al. (2013) klar erläutert, wird bei der SPRM (Oberflächenplasmonenresonanzmikroskopie) die Aktivierung von Oberflächenplasmonen genutzt, um gleichzeitig den oberflächennahen Brechungsindex an mehreren Stellen einer Probenoberfläche zu untersuchen.
Das erzeugte Feld kann auch zur Aktivierung von Fluorphoren verwendet werden, wie es bei SPFS oder SPRF der Fall ist. Die Vorzüge dieser Technik liegen in der hohen Empfindlichkeit in Echtzeit, der bis zu 80-fachen Verstärkung der Intensität des einfallenden Feldes und der Unterdrückung von unerwünschtem Hintergrundlicht durch das reflektierte Feld.
Frühere SPRM/SPRF-Systeme, die mit Lasern ausgestattet sind, weisen hervorragende Eigenschaften auf, darunter eine geringe Bandbreite und eine erhöhte Leistung (Huang & Yu, 2013). Dennoch wurde die Wirksamkeit von SPRM/SPRF bei der Bildgebung durch Speckle-Artefakte, die durch die Laserbeleuchtung verursacht werden, stark beeinträchtigt. Dies beeinträchtigt die Fähigkeit des Doppelsystems, bestimmte Regionen gleichzeitig zu verfolgen und zu identifizieren.
Um die vorgenannten Probleme zu beseitigen, enthält die Systembaugruppe konvektive Laserpointer und akustische Wandler (Anti-Despeckle). Insbesondere ist die Durchflusszelle mit dunklem Mylar abgedeckt, um die Kohärenz des emittierten Anregungslichts zu verbessern.
Dadurch wird die Synchronisierung der Messungen an bestimmten Stellen der Durchflusszelle weiter verbessert. Mit diesem System soll “ein äußerst kosteneffizientes System demonstriert werden, das in der Lage ist, eine Probe gleichzeitig mit SPRM und SPRF abzufragen und dabei räumlich zwischen verschiedenen Regionen derselben Probe zu unterscheiden” (Fort & Grésillon, 2013).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mit den oben genannten Anpassungen am Doppelsystem die beiden Systeme gleichzeitig und erfolgreich Oberflächen abbilden können. Das gesamte Experiment, das zeigt, wie dies erreicht wird, ist in der Literatur zu finden. Es gibt auf dem Markt Instrumente, die einige der oben genannten Effekte einzeln erzielen können. Das SPRM/SPRF-System bietet dem Benutzer jedoch die Möglichkeit, alle Effekte in einer einzigen Anwendung zu erleben, die sehr kosteneffizient ist.
Die Verwendung der SPFS-Spektroskopie bei der Analyse der Antikörper-Antigen-Interaktion
Das zugrundeliegende Prinzip der SPFS-Spektroskopietechnik besteht darin, dass ein übergeordnetes elektromagnetisches Feld, das von einem Oberflächenplasmon ausgeht, zur Verstärkung der Anregung von oberflächengebundenen Fluorophoren verwendet wird. Der Vorteil der SPFS-Technik bei der Analyse von Oberflächen-Immunreaktionen besteht darin, dass sie in der Lage ist, sowohl die Veränderungen der Grenzflächendicke als auch die Inkandeszenzsignale in Echtzeit zu untersuchen.
Im Hinblick auf diese Anwendung wurden Goldoberflächen mit Hilfe einer selbstorganisierten Monoschicht aktiviert. Dadurch konnte ein Antigen in einem weiten Bereich variabel in seiner Dichte exponiert werden. Mit Hilfe von SFPS-basierten Immunoassays wurden spezifische Antikörper-Antigen-Reaktionen für die Antigen-Antikörperlösungen registriert, die sich mit hoher Geschwindigkeit über die Oberflächen bewegten. In einer ersten Analyse wurde die Bedeutung der “Fluorophore Cy5 und Alexa Fluor 647 in SPFS-basierten Immunoassays” untersucht (Cai & Jun, 2012).
Die Ergebnisse zeigten, dass Cy5 ein hervorragendes Selbstabschreckungsverhalten aufweist, das die quantitativen Messungen negativ beeinflusst. Darüber hinaus wurde bestätigt, dass die bei den In-situ-Messungen beobachteten Winkelverschiebungseffekte hinsichtlich der Bindungskinetik ein großes Hindernis darstellen. Sie beeinträchtigen die Glühsignale an dem Punkt, an dem große SPR-Signale aufgezeichnet werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass SPFS-basierte Immunoassays für die Analyse der Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen von entscheidender Bedeutung sind, wie hier bereits erläutert wurde.
SPFS als Anwendung in Kolloiden
Für diese Anwendung wird in der nachstehenden Literatur der Effekt der Verschmelzung von Oberflächenplasmonen und feldverstärkter Spektroskopie im Sensorverhalten beschrieben. Die Resonanzaktivierung von PSP-Komponenten an einer Metall/Puffer-Grenze in einer Durchflusszelle verstärkt die optische Feldstärke relativ zum einfallenden Laserlicht. Die Fresnel-Formel bestätigte, dass die Stärke des resultierenden Feldes bei einer Gold-Wasser-Grenze tatsächlich um das 16-fache des einfallenden Lichts verstärkt wird (Tawa & Morigaki, 2013).
Das daraus resultierende Feld ist nützlich, um die Empfindlichkeit bei der Untersuchung von Bindungseffekten eines Analyten zu erhöhen, der eine wässrige Phase an der funktionalisierten Gold-Wasser-Grenzfläche zu den Nachweisstellen durchquert (Liebermann & Knoll, 2012). Dies geschieht unter der Voraussetzung, dass sich die zuvor fluoreszenzmarkierten Analytpartikel im Bereich eines exponentiell abklingenden zeitlichen Feldes befinden, das durch den PSP-Modus erzeugt wird.
Dies hindert die Analytmoleküle auch daran, sich einem Metall zu nähern, ein Rezept, das für die Verstärkung der Forster-Löschung in Bezug auf die emittierte Fluoreszenz wichtig ist (Liebermann, 2012). Um die Bedeutung von SPFS zu untersuchen, wird eine quantitative Analyse durchgeführt, um sowohl die Größe der Fluoreszenz als auch den Brechungsindex oder die Schichtdicke zu untersuchen. Die Analyse beantwortet die oben genannten Fragen, indem sie den Bindungsprozess von fluoreszenzdotierten Latexmolekülen untersucht (Sonnefraud, 2012).
Diese Moleküle besitzen zusätzliche oberflächliche Biotin-Moleküle, die es ihnen ermöglichen, sich an eine Streptavidin-Phase an der Gold-Puffer-Grenze zu binden. Die Bedeutung der SPFS-Technik zeigt sich auch darin, dass sie in der Lage ist, Fluoreszenzintensität nachzuweisen, die von vernachlässigbarer PSP-Resonanz ausgeht. Dies ist bei biotinylierten Chromophoren der Fall, bei denen die Bindung erheblich verdünnt ist (Lakowicz et al., 2013).
Schlussfolgerung
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Errungenschaften der SPFS im Bereich der optischen Techniken beispiellos sind. Seit ihrer Gründung hat die SPFS die optische Technik zu neuen Höhen geführt und Analysen, die zunächst schwierig erschienen, zum Erfolg geführt.
Durch einfache Anregung der oberflächengebundenen Fluorophore mit Hilfe eines hervorragenden elektromagnetischen Feldes, das von Oberflächenplasmonen ausgeht, kann das Verhalten des Analyten anhand der emittierten Fluoreszenz bestimmt werden. Einer der Vorzüge, die SPFS gegenüber anderen optischen Techniken auszeichnen, ist die beispiellose Empfindlichkeit in Echtzeit. In dieser Hinsicht wurden wichtige Meilensteine erreicht, so dass diese Technik zur Untersuchung des Verhaltens winziger Komponenten auf molekularer Ebene und darüber hinaus eingesetzt werden kann.
Referenzen
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